PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案

2017-12-11 11:32:32 nmglob 110

PCR产物的电泳检测时间,一般为48h以内,有些最好于当日进行检查,大于48h后带型不规则甚至消失。
但有时仍会与到这样那样的问题,影响检测结果的判断,具体归类为以下常见的4点,描述如下:

问题一:无扩增产物
现象:正对照有条带,而样品则无

原因:
1、模板:含有抑制物,含量低
2、Buffer对样品不合适
3、引物设计不当或者发生降解
4、反应条件:退火温度太高,延伸时间太短

对策:
1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量
2、更换Buffer或调整浓度
3、重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物
4、降低退火温度、延长延伸时间

问题二:非特异性扩增
现象:条带与预计的大小不一致或者非 特异性扩增带

原因:
1、引物特异性差
2、模板或引物浓度过高
3、酶量过多
4、Mg2+浓度偏高
5、退火温度偏低
6、循环次数过多

对策:
1、重新设计引物或者使用巢式PCR
2、适当降低模板或引物浓度
3、适当减少酶量
4、降低镁离子浓度
5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法
6、减少循环次数

问题三:拖尾
现象:产物在凝胶上呈Smear状态

原因:
1、模板不纯
2、Buffer不合适
3、退火温度偏低
4、酶量过多
5、dNTP、Mg 2+浓度偏高
6、循环次数过多

对策:
1、纯化模板
2、更换Buffer
3、适当提高退火温度
4、适量用酶
5、适当降低dNTP和镁离子的浓度
6、减少循环次数

问题四:假阳性
现象:空白对照出现目的扩增产物

原因:
靶序列或扩增产物的交叉污染

对策:   
1、操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;
2、除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3、各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存